Introduction
항생물질은 주로 인간과 가축의 질병 예방, 치료의 목적으로 사용되고 그 외에도 가축의 성장 촉진용으로 많이 사용 되어 진다 (Kim et al., 2018; Seo et al., 2018). 그러나 환경 중에 항생물질의 잔류로 인한 항생물질 저항 박테리아 생성과 같은 문제가 발생하면서 1980년 말부터 항생물질을 신종 오염물질 (emerging contaminants)로 간주하였다 (Kivits et al., 2018).
인간과 가축에게 투여되는 항생물질은 10-20%만이 생체 내에서 활용되고, 80-90%가 소변, 대변 등의 분뇨의 형태로 배출된다 (Kumar et al., 2005; Masse et al., 2014). 배출된 항생제는 비점오염원의 형태로 수계로 유입되며 항생물질이 환경 내에 잔류하게 되는 주요 경로는 인간과 가축에 사용된 후 환경에 배출되는 경로, 수산용으로 사용되는 항생물질이 수계 내로 유입되는 경로, 그리고 항생물질이 생산되는 과정에서 직접 유출되는 경로 등 크게 3가지로 나뉠 수 있다 (Blackwell et al., 2009; Spielmeyer et al., 2017).
2015년 지하수 조사 연보 통계에 의하면 우리나라 전국 156만개 관정에서 연간 전체 지하수 이용량 40.9억 m3 yr-1 중 농어업용으로 사용되는 지하수의 양은 약 21.1억 m3 yr-1으로 전체 이용량의 51.6%를 이용하고 있다. 하지만 2015년 지하수 수질검사 결과 농촌지역 지하수 수질 오염 기준 초과율이 약 17.8%로 일반지역 (6.3%)에 비해 약 3배의 오염 기준 초과율을 나타냈다. 특히 2011-2012년 구제역과 AI 등에 의해 전국 약 4,679 개소의 가축 매몰지가 생겨남에 따라 침출수에 의한 주변 관정 지하수의 안전성에 대한 우려가 높아지고 있다.
농촌 지역 지하수의 주요 오염원은 농경지에 사용된 비료 또는 농약, 그리고 축산폐수 및 가축 분뇨 등이지만 최근 항생물질 또는 항생물질 저항 유전자 (ARG, Antibiotic Resistance Genes)와 같은 신종오염물질의 농촌 지하수 유입에 대한 가능성이 높아 지고 있다 (Kemper, 2008). 특히 축사 주변에 위치한 지하수의 경우 질산성 질소 또는 항생물질과 같은 오염물질의 유입을 초래할 수 있다 (Burri et al., 2019). 미국의 경우 대단위 가축 사육 농장 인근 지하수에서 설폰아마이드 계열의 sulfamethazine이 3.6 µg L-1의 농도로 검출되었으며 독일의 경우 농촌지역의 105개 지하수에 대해 수질을 검사한 결과 22종류의 동물용 항생제가 최대 0.41 µg L-1의 농도로 검출되었다 (Watanabe et al., 2010; Sacher et al., 2001). 국내의 경우 농촌 지역의 지하수를 대상으로 33개의 의약품에 대해 조사한 결과 약 31종류의 의약품이 not detected-49.3 ng L-1 범위 수준에서 검출되었다 (Lee et al., 2019).
본 연구에서는 농촌 지역의 지하수 수질 중 동물용 항생제의 잔류 특성을 모니터링 한 후 가축 농장으로부터 인근 지하수로의 동물용 항생제 유입 가능성을 평가하였다.
Materials and Methods
시약 및 재료
본 연구에서 사용된 항생물질은 설폰아마이드 (sulfonamide) 계열 항생제 3종인 설파메타진 (sulfamethazine, SMZ), 설파티아졸 (sulfathiazole, STZ) 그리고 설파메토자졸 (sulfamethoxazole, SMX)이였으며 FLUKA (USA)의 제품을 사용하였다 (Fig. 1). 항생물질의 정량을 위한 내부 표준물질로는 Accustandard사의 Simeton (673-04-1, 100 µg mL-1, USA)을 사용하였다. 기기 분석을 위해 사용한 유기 용매인 메탄올 (methanol, MeOH), 아세토나이트릴 (acetonitrile, ACN), 그리고 물은 모두 HPLC등급을 사용하였다.
가축 매몰지 선정 및 시료채취
시료 채취는 전국 5개 지역 (강원, 경기, 충남, 충북, 전남)에서 축종별 (돼지, 소, 가금류) 농장이 위치한 지점을 중심으로 최소 반경 500 m 이내에 있는 지하수 관정에서 채취하였으며 대조구 시료는 최소 반경 2 km 이내에 가축 농장이 위치하지 않은 관정을 선택하여 채취하였다 (Fig. 2). 지하수 시료 채취는 베일러 (bailer)를 이용하였으며 채취된 시료는 500 mL 시료 채취용 백에 담은 후 실험실로 옮겨져 4°C에서 냉장보관을 하였다.
전처리 및 항생제 추출
항생제 분석을 위한 시료의 전처리는 시료 120 mL를 0.45 µm 여과지를 이용하여 감압여과 후 250 mL 삼각플라스크에 취하였다. 여과된 시료에 40% H2SO4 (v/v)를 사용하여 시료의 pH를 2.5 ± 0.1로 조절하고 5% EDTA (w/v) 500 µL을 가한 후, 상온에서 150 rpm으로 15 분간 교반 하였다.
전처리 된 시료는 고형상 추출법 (SPE, solid phase extraction)을 이용하여 추출하였다. 메탄올, 0.5N HCl, 3차 증류수를 순서대로 3 mL씩 3 cc 60 mg 용량의 HLB 카트리지 (Oasis, Waters, USA)에 흘려보내 카트리지를 활성화 하였다. 시료를 카트리지에 통과시키기 위해 Teflon tube를 연결하여 유속을 2 mL min-1으로 조절하여 시료를 첨가하였으며 시료가 카트리지를 모두 통과하면 1분간 더 감압을 하여 카트리지를 완전히 건조시킨 후, 증류수 3 mL를 3회 카트리지에 흘려보내 세척 하였다. 카트리지에 흡착된 항생물질은 메탄올 5.0 mL를 이용하여 카트리지에서 분리한 후 추출액이 수집된 튜브에 내부표준물질인 simeton 50 µL (0.24 mg L-1) 를 넣어 가볍게 흔들어주었다. 추출된 시료는 질소농축기 (N-EVAP-11, OASYS)에서 50°C를 유지하면서 50 µL까지 농축한 후 Mobile Phase A (0.1% formic acid + 99.9% 초순수 증류수) 70 µL를 가하여 최종적으로 120 µL를 Vial insert에 취해 -20°C에서 냉동보관 하였다.
LC-MS/MS 분석
항생물질 분석에 사용된 기기는 충남대학교 공동실험실습관의 High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometer (HPLC/MS/MS, 4000 Q trap, ABSCIEX, USA)를 사용하였으며, 이동상의 조성은 A, 99.9% HPLC grade water + 0.1% formic acid(v/v); B, 99.9% acetonitrile + 0.1% formic acid(v/v)를 사용하였다. 항생제 분석에 사용된 컬럼은 공극 크기 (pore size)가 3.5 µm이며, 내경이 4.6 mm인 Zorbax Eclipse Plus-C18 (Agilent Technologies, USA)을 사용하였다. 항생제 분석을 위한 HPLC/MS/MS 조건은 다음과 같다 (Table 1).
Table 1. optimized condition of HPLC/MS/MS for VAs analysis.
항생제 분석에 대한 QA/QC
항생제 농도 정량을 위한 검량 곡선은 각 성분별로 표준용액 (100 mg L-1)을 이용하여 0.01, 0.02, 0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 mg L-1의 농도로 제조한 후 작성하였다. 항생물질 각 성분에 대한 회수율은 대조구 (항생물질이 들어있지 않은 순수한 증류수)에 0.10, 1.00 mg L-1 농도의 항생물질을 인위적으로 주입한 후 시료 분석 방법과 동일한 방법으로 추출하여 정량 산출하였다.
Results and Discussion
시료의 이화학적 특성
시료의 이화학적 특성은 Table 2에 정리하였다. 각 지역별로 가축 농장의 영향을 받지 않은 대조구는 A로 표시하였으며 농장 인근 지역의 지하수는 B로 표시하였다. 수질의 pH 범위는 6.2-7.6으로 농업용 지하수의 수질 기준인 6.0-8.5 범위 내에 존재하였다. 전기전도도인 EC와 암모니아태 질소의 농도 범위는 각각 175.5-809.0 µS cm-1와 0.1-0.6 mg L-1였으며, 이는 2016년 환경부에서 조사한 지하수 수질 측정망의 자료 (EC: 18-13,092 µS cm-1, 평균값 437 µS cm-1)와 비교하였을 경우 농촌 지역 지하수의 수질 특성과 큰 차이가 없었다. 염소이온 (Cl-)과 질산태 질소 이온 (NO3-)의 농도 범위는 각각 3.1-132.3과 1.1-83.0 mg L-1 였으며, 농업용 지하수의 수질 기준과 비교하였을 경우 염소 이온은 모두 기준 이하였고 질산태 질소 이온의 경우 강원 지역 농장 인근 지하수를 제외하고는 모두 기준 이하인 것으로 조사되었다. 강원 지역 농장 인근 지하수의 경우 기준인 20.0 mg L-1에 비해 약 4배 이상 높은 83.0 mg L-1의 질산성 질소 농도가 검출되었으며 이 지역은 축사 내에 지하수 관정이 위치해 있어 축산 분뇨에 의한 질소 유입 가능성이 있는 것으로 사료 된다.
Table 2. Summary of chemical properties of sample.
항생제 분석의 회수율
설폰아마이드 계열의 3가지 항생제에 대한 검량선 작성 결과 R2는 평균 0.99로 측정되었으며 회수율은 SMZ, SMX, STZ 각각의 성분에 대해 129, 106, 88%의 회수율을 나타내었다 (Table 3). 환경부에서 제시한 QA/QC 핸드북에 의하면 유기 오염 물질의 회수율 범위는 70-130%로 되어 있으며 3가지 항생제 모두 허용 범위 내에 존재하였다.
Table 3. Coefficient of determination and recovery of three sulfonamide compounds.
| Sulfonamides | |||
| SMZ | SMX | STZ | |
| Recovery (%) | 129 | 106 | 88 |
| R2 | 0.99 | 0.99 | 0.99 |
농촌 지하수 내 항생제 잔류 농도
총 3종류의 설폰아마이드 계열 항생제에 대한 잔류 농도는 Table 4에 정리하였다. 3종류의 항생제 중 설파메타진 (SMZ) 만이 26.6-40.0 ng L-1의 농도 범위에서 검출되었으며 나머지 2종류의 항생제인 SMX와 STZ는 모두 검출 한계 미만으로 분석되었다. Hannappel et al. (2014)와 Balzer et al. (2016)의 연구에 의하면 가축 농장 밀집 지역의 지하수에서 설폰아마이드 계열의 항생제를 분석한 결과 설파메타진 (SMZ)과 설파디아진 (sulfadiazine)이 12 ng L-1 미만의 농도로 검출되었으며 설파메토자졸 (SMX)이 약 950 ng L-1을 초과하였다. 네델란드의 경우 설폰아마이드 계열의 항생제 중 SMZ와 SMX의 최대 검출 농도가 각각 21, 50-75 ng L-1로 조사되었으며 설파디아진의 경우 검출 최대 농도가 30 ng L-1로 보고되었다 (Chitescu et al., 2012). 본 연구에서 검출된 항생제의 농도와 선행 연구의 결과를 비교하였을 경우 지하수에서 검출되는 설폰아마이드 계열의 항생제 평균 농도는 100 ng L-1 미만으로 사료된다.
Table 4. Concentration of Sulfonamide in the groundwater.
동물용 항생제는 항생제 각각의 특성에 따라 환경에 유입될 경우 이동 및 거동의 형태가 다르다. 설폰아마이드 계열의 항생제는 다른 계열의 동물용 항생제 (Tetracycline, Macrolide, β-Lactam, Lincosamide, Quinolone etc)에 비해 흡착 계수 (Kd) 범위가 0.2-3.1 L kg-1로 매우 낮으며 이는 환경에 유입될 경우 고형상에 흡착되는 형태 보다는 물에 용존되어 지하수로 유입될 수 있는 가능성이 높은 항생제이다. 이와 반면 tetracycline (Kd: 400-1,620 L kg-1)과 quinolone (Kd: 310-430 L kg-1) 계열의 항생제는 환경에 유입된 후 고형상에 흡착되어 지하수로의 유입 가능성이 매우 낮다 (Kivits et al., 2018). 따라서 본 연구에서 검출된 설폰아마이드 계열의 항생제는 가축에게 투여된 항생제가 체외로 배출된 후 강우와 같은 비점오염원의 형태로 지하수로 유입된 것으로 판단된다.
강원, 경기, 충남 지역의 대조구와 가축 농장 인근 지하수 내의 SMZ 농도를 비교하였을 경우 농도차가 없는 것으로 조사되었다. 이는 지하수로 유입되는 항생제의 경우 가축 농장에서 유출되는 분뇨의 영향 보다는 농경지에 투입되는 퇴비 내에 잔류하는 항생제가 강우에 의해 지하수로 유입되는 것으로 판단되었다. 하지만 이에 대한 보다 자세한 연구는 필요하다.
Conclusion
농촌 지역 지하수 내의 동물용 항생제 잔류 가능성을 평가하기 위해 설폰아마이드 계열 항생제인 SMZ, SMX, STZ를 분석하였다. 분석 결과 3 종류의 항생제 중 SMZ만이 26.6-40.0 ng L-1 수준에서 검출되었으며 나머지 2종류의 항생제는 검출 한계 미만으로 조사되었다. 고형상 매질과 흡착이 잘 이루어지지 않으며 물에 잘 녹는 특성을 가진 설폰아마이드 계열의 항생제는 가축에 투여된 후 체외로 배출되어 비점오염원의 형태로 농장 인근 지하수로 유입되었을 것으로 추정되었다. 향후 다양한 계열의 동물용 항생제에 대한 지하수 유입 가능성을 평가하여 안전한 농촌 지하수를 확보하기 위한 관리 방안이 필요할 것으로 사료 된다.
